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⑴ 转化受体可以是多种类型 ATMT转化的受体材料可以是多种类型的, 既可以用原生质体, 也可以用分生孢子、菌丝甚至真菌组织体。 ⑵ 转化效率高 同传统的真菌转化方法, 如PEG-CaCl2法相比, ATMT方法的转化效率有明显提高。 ⑶ 单拷贝的随机插入 ATMT的非同源转化, 大部分转化子为单拷贝的T-DNA插入。 ⑷ 转化子稳定 M.purpureus的ATMA转化子经过四轮孢子培养及筛选过程后, 98%的克隆仍然表现出对潮霉素的抗性。
⑴ 双元载体的构建及工程菌株的制备 将具有合适真菌启动子的筛选标记基因插入到T-DNA的左边界和右边界之间, 然后把构建好的双元载体 (binary vector) 通过冻融法等方法导入A.tumefaciens中。 ⑵ 工程菌株的培养与处理 接种含双元载体的根癌农杆菌工程菌株到含有合适抗生素的MM (minimal medium) 培养液 (Casas-Flores et al., 2004) 中, 28℃, 200r/min培养1-2d。 ⑶ 共培养及转化子的筛选、鉴定 将上述 A.tumefaciens 菌液与等体积的真菌分生孢子悬浮液混合, 把混合液涂布在铺有玻璃纸固体IM培养基上, 在适宜的温度 (通常为28℃) 下共培养2-3d后, 将玻璃纸转移至适于真菌生长的固体培养基上, 于适宜温度下 培养数天 (4-5d) , 直至出现抗性菌落。
⑴ 根癌农杆菌（EHA105）的转化OD值 根癌农杆菌介导的高效转化需要合适的农杆菌浓度，即需要与真菌的孢子数目保持一定的比例关系。农杆菌浓度太小则相对于单个真菌孢子而言达不到转化所需要的浓度，浓度过大则可能会抑制孢子的生长,导致转化失败或者转化效率太低。 ⑵ 乙酰丁香酮(acetosyingone, As)的浓度 共培养基中As能起到诱导活化农杆菌vir基因的作用，浓度太低会导致农杆菌病毒蛋白表达量不够，难以完成转化，AS浓度过大可能会导致T-DNA插入的拷贝数目增加。 ⑶ 菌体浓度对转化效率的影响 转化受体的细胞浓度和农杆菌的浓度都影响转化效率。较高的受体孢子浓度转化率相对较高。但其最高使用浓度有一定的界限, 当受体真菌的细胞浓度过高时则导致真菌的过量生长而不能挑出转化子, 使转化效率降低。 ⑷ 选择标记 以潮霉素磷酸转移酶 (hygromycin B phosphotransferase, hph) 基因作为选择标记基因。 ⑸ 共培养时间对转化效率的影响 共培养时间的长短关系到农杆菌vir基因的表达及其蛋白的活化以及T-DNA的剪切和复合物向孢子内的转移,过短的共培养时间将导致转化无法顺利完成.但是共培养时间太长,非转化子对转化子生长的竞争作用将导致转化效率降低,加大假阳性出现的概率。 ⑹ 共培养温度对转化效率的影响 共培养温度也是影响转化效率的重要因素, 已有研究发现22~25℃是最适的转化温度。
Reference： [1] 黄亚丽,潘玮,蒋细良,郭平,田云龙,李记鹏,朱昌雄.根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展[J].生物技术通报,2007(03):111-114. [2] 迟彦,周东坡,平文祥,李姗姗,朱婧.根癌农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用[J].菌物学报,2005(04):142-149.
8668神淡淡
中间表达载体是不能将外源基因转化进植物细胞，因此，必须将中间表达载体引入到已改造的受体Ti质粒中，并构建成能侵染植物细胞的基因转化载体，才能在植物基因转化中应用。为利用根癌农杆菌的Ti质粒，发展了一元载体系统和双元载体系统。一元载体系统是指首先将目的基因插入到中间表达载体上，筛选出含有目的基因的重组分子，然后将重组质粒转化到根癌农杆菌中，重组质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞，T-DNA重组分子就可整合到植物细胞染色体DNA上，再利用植物选择标记基因筛选转化细胞。
简单而言，一元载体系统就是指含有目的基因的中间表达载体与改造后的受体Ti质粒通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常又称为共整合载体（co-integrated：vector），由于该载体的T-DNA区与Ti质粒Vir区连锁，因而又称为顺式载体（cis-vector）。
双元载体（binary：vector）系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。其中之一是含有T-DNA转移所必需的Vir区段质粒，它缺失或部分缺失T-DNA序列。它的主要作用是表达毒蛋白，激活T-DNA的转移，故称为辅助Ti质粒（helper：Ti：plasmid）；另一个则是含有T-DNA的质粒。一般作为目的基因的载体，由于其分子量较小，故称为微型质粒（mini-Ti：plasmid），它是一种寄主范围广泛的DNA转移载体质粒，它既含有大肠杆菌复制起始位点，又含有根癌农杆菌复制起始位点，实际上是一种大肠杆菌—农杆菌穿梭质粒。这两种质粒在单独存在的情况下，均不能诱导植物产生冠瘿瘤；若根癌农杆菌细胞内同时存在这两种质粒时，便可获得正常诱导肿瘤的能力，因此，含有双元载体的根癌农杆菌细胞侵染植物时，就可以将含有目的基因的T-DNA整合进植物基因组中。
目前以T-DNA转化植物细胞的标准方法大多采用Ti质粒介导的双元载体系统。首先将目的基因插入到微型质粒，含有目的基因的重组微型质粒转化大肠杆菌后，再导入携带辅助Ti质粒的根癌农杆菌中，经筛选后直接感染植物细胞。根癌农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的vir基因，随后将微型质粒上的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。
由于双元载体系统的T-DNA和Vir区在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故又称为反式载体（trans-vector）。
