辛燃arzue
不使用连接酶克隆 不需要连接的克隆方式： Ligation-Independent cloning ，简称LIC。采用LIC方法的pET载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列，PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC载体上。 一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进行表达。而pETcoco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS和repE元件与parABC共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达，质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。pETcoco载体同时兼容了DE3调控模型，在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。 不使用连接酶克隆—— ligation independent cloning 限制性内切酶切，连接酶链接形成重组质粒的克隆方法简单方便，但是作为上一个generation已经慢慢失去他的魅力。随着high throughput的时代来临，结构基因组学研究需要更高效率的克隆技术，于是LIC和Gateway就被广泛使用。这里发一篇Method paper关于slic的综述。这个方法的好处还可以串联接入多个片段，可以一步解决loop deletion和长片段克隆的问题。
张小凡09
这周二组会期间。导师提起要将实验室所有构建的载体在Geneious里面统一管理。然后顺便问了一句是不是大家都会使用Geneious进行载体构建。然后提了一句，总不会有人的载体图谱是靠复制黏贴绘制的吧。我想说我就是那个不会操作的人，突然间发现自己就是拿着屠龙宝刀当砍柴刀用-暴殄天物啊！ 作为一个老博士生，分子生物学最基础的载体构建都不会就有点说不过去了。于是我花了半天时间来摸索如何使用Geneious模拟实验条件下的载体构建。终于搞得七七八八了。废话少说，上菜！ 这里我想将水稻OsNHX4连接到1300 35S-NeGFP载体NeGFP的后面。我们知道对于融合蛋白载体的构建，主要是需要保证基因不能发生移码突变。我们查看载体，发现紧邻eGFP的Sac I 可以将载体进行线性化（整个载体中，Sac I 只有这一个酶切位点）。步骤是：>点击Cloning >Digest into fragments 将载体线性化后，我们总共得到三个文件，当选中被线性化的载体序列放大后，我们能看到线性化载体的两端都有一个Sac I酶切后形成的overhang 由于在重组过程中，5‘-外切酶会将载体的粘性末端切除，为了好设计引物，在这里，我们需要重新把将要被切除的序列重新添加到Sac I前面并注释好。由于Sac I识别的位点是GAGCTC,而在载体上还存在一个G,因此我们需要补齐后面的5个碱基AGCTC，并保存好。 接下来，选中目的基因及修改好的线性化的载体，并依次点击cloning ,再选择Gibson assembly点击Gibson assembly之后，我们可以看到下面的界面，在这里需要设计两个地方：第一个是选择Backbone,即选择线性化的载体作为Backbone。其次需要将外切酶选为5‘-外切酶，然后再确定。 最后，重组载体就构建好了，并且会出现相应的重组载体，PCR扩增的引物以及一份报告。到这就大功告成了。点击重组的载体，你会发现这与你实际试验应该是吻合的。
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