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克隆”是从英文“clone”音译而来，在生物学领域有3个不同层次的含义。 1．在分子水平，克隆一般指DNA克隆(也叫分子克隆)。含义是将某一特定DNA片断通过重组DNA技术插入到一个载体(如质粒和病毒等)中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片断的“群体”。 2．在细胞水平，克隆实质由一个单一的共同祖先细胞分裂所形成的一个细胞群体。其中每个细胞的基因都相同。比如，使一个细胞在体外的培养液中分裂若干代所形成的一个遗传背景完全相同的细胞集体即为一个细胞克隆。又如，在脊椎动物体内，当有外源物(如细菌或病毒)侵入时，会通过免疫反应产生特异的识别抗体。产生某一特定抗体的所有浆细胞都是由一个B细胞分裂而成，这样的一个浆细胞群体也是一个细胞克隆。细胞克隆是一种低级的生殖方式－无性繁殖，即不经过两性结合，子代和亲代具有相同的遗传性。生物进化的层次越低，越有可能采取这种繁殖方式。 3．在个体水平，克隆是指基因型完全相同的两个或更多的个体组成的一个群体。比如，两个同卵双胞胎即为一个克隆！因为他（她）们来自同一个卵细胞，所以遗传背景完全一样。按此定义，“多利”并不能说成是一个克隆！因为“多利”只是孤单的一个。只有当那些英国胚胎学家能将两个以上完全相同的细胞核移植到两个以上完全相同的去核卵细胞中，得到两个以上遗传背景完全相同的“多利”时才能用克隆这个词来描述。所以在那篇发表于1997年2月出版在《Nature》杂志上的轰动性论文中，作者并没有把“多利”说成是一个克隆。 另外，克隆也可以做动词用，意思是指获得以上所言DNA、细胞或个体群体的过程。 二、克隆技术 1．DNA克隆 现在进行DNA克隆的方法多种多样，其基本过程如下图所示(未按比例) 可见，这样得到的DNA可以应用于生物学研究的很多方面，包括对特异DNA的碱基顺序的分析和处理，以及生物技术工业中有价值蛋白质的大量生产等等。 2．生物个体的克隆 (1)植物个体的克隆 在20世纪50年代，植物学家用胡萝卜为模型材料，研究了分化的植物细胞中遗传物质是否丢失问题，他们惊奇地发现，从一个单一已经高度分化的胡萝卜细胞 可以发育形成一棵完整的植株!由此，他们认为植物细胞具有全能性。从一棵胡萝卜中的两个以上的体细胞发育而成的胡萝卜群体的遗传背景完全一样，故为一个克隆。如此的植物的克隆过程是一个完全的无性繁殖过程! (2)动物个体的克隆 ① “多利”的诞生 1997年2月27日英国爱丁堡罗斯林(Roslin)研究所的伊恩·维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”(Dolly)诞生，这一消息立刻轰动了全世界。 “多莉”的产生与三只母羊有关。一只是怀孕三个月的芬兰多塞特母绵羊，两只是苏格兰黑面母绵羊。芬兰多塞特母绵羊提供了全套遗传信息，即提供了细胞核（称之为供体）；一只苏格兰黑面母绵羊提供无细胞核的卵细胞；另一只苏格兰黑面母绵羊提供羊胚胎的发育环境——子宫，是“多莉”羊的“生”母。其整个克隆过程简述如下： 从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度的营养培养液中，细胞逐渐停止了分裂，此细胞称之为供体细胞；给一头苏格兰黑面母绵羊注射促性腺素，促使它排卵，取出未受精的卵细胞，并立即将其细胞核除去，留下一个无核的卵细胞，此细胞称之为受体细胞；利用电脉冲的方法，使供体细胞和受体细胞发生融合，最后形成了融合细胞，由于电脉冲还可以产生类似于自然受精过程中的一系列反应，使融合细胞也能象受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成胚胎细胞；将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内，胚胎细胞进一步分化和发育，最后形成一只小绵羊。出生的“多莉”小绵羊与多塞特母绵羊具有完全相同的外貌。 一年以后，另一组科学家报道了将小鼠卵丘细胞(围绕在卵母细胞外周的高度分化细胞)的细胞核移植到去除了细胞核的卵母细胞中得到20多只发育完全的小鼠。如呆“多利”因为只有一只，还不够叫做克隆羊的话，这些小鼠 就是名副其实的克隆鼠了。 ② 通过细胞核移植克隆小鼠的基本过程 在本实验中，卵丘细胞是经如下过程得到的：通过连续几次注射绒毛膜促性腺激素，使雌鼠诱导成高产卵量状态。然后从雌鼠输卵管中收集卵丘细胞与卵母细胞的复合体。经透明质酸处理使卵丘细胞散开。选择直径为10－12微米的卵丘细胞用作细胞核供体（前期实验表明，若用直径更小或更大的卵丘细胞的细胞核，经过细胞核移植的卵母细胞很少发育到8细胞期）。所选择的卵丘细胞保持在一定的溶液环境中，在3小时内进行细胞核移植（与此不同的是，在获得“多利”时用作细胞核供体的乳腺细胞先在培养液中传代了3－6次） 卵母细胞（一般处于减数分裂中期 II ）通过与上面描述类似的方法，从不同种的雌鼠中收集。在显微镜下小心地用直径大约7微米的细管取出卵母细胞的细胞核，尽量不取出细胞质。同样小心取出卵丘细胞的细胞核，也尽量去除所带的细胞质（通过使取出的细胞核在玻璃管中往复运动数次，以去除所带的少量的细胞质）。在细胞核被取出后5分钟之内，直接注射到已经去除了细胞核的卵母细胞中。进行了细胞核移植的卵母细胞先放在一种特制的溶液中1－6小时，然后加入二价的锶离子（Sr2+）和细胞分裂抑素B。前者使卵母细胞激活，后者抑制极体的形成和染色体的排除。再取出处理过的卵母细胞，放在没有锶和细胞分裂抑素B的特制的溶液中使细胞分裂形成胚胎。 不同阶段的胚胎（从2细胞期到胚泡期）被分别植入几天前与已经结扎雄鼠交配过的假孕母鼠的输卵管或子宫中发育。发育完全的胎儿鼠在大约19天后通过手术取出。 目前胚胎细胞核移植克隆的动物有小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、牛和猴子等。在中国，除猴子以外，其他克隆动物都有，也能连续核移植克隆山羊，该技术比胚胎分割技术更进一步，将克隆出更多的动物。因胚胎分割次数越多，每份细胞越少，发育成的个体的能力越差。体细胞核移植克隆的动物只有一个，就是“多利”羊。 三、克隆技术的福音 1． 克隆技术与遗传育种 在农业方面，人们利用“克隆”技术培育出大量具有抗旱、抗倒伏、抗病虫害的优质高产品种，大大提高了粮食产量。在这方面我国已迈入世界最先进的前列。 2． 克隆技术与濒危生物保护 克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一。 3． 克隆技术与医学 在当代，医生几乎能在所有人类器官和组织上施行移植手术。但就科学技术而言，器官移植中的排斥反应仍是最为头痛的事。排斥反应的原因是组织不配型导致相容性差。如果把“克隆人”的器官提供给“原版人”，作器官移植之用，则绝对没有排斥反应之虑，因为二者基因相配，组织也相配。问题是，利用“克隆人”作为器官供体合不合乎人道？是否合法？经济是否合算？ 克隆技术还可用来大量繁殖有价值的基因，例如，在医学方面，人们正是通过“克隆”技术生产出治疗糖尿病的胰岛素、使侏儒症患者重新长高的生长激素和能抗多种病毒感染的干挠素，等等。
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前面我们讲了拿到一个质粒后对它做快速的基本了解，接下来重点部分就是如何快速阅读质粒图谱。 质粒的命名 拿到一个质粒，第一眼看到的肯定是它的名字，那质粒是怎么命名的？ 最初发现的质粒均有研究者根据其表型，大小特征命名，如F因子(fertility factor，致育因子)，R质粒(resistance factor)等。后来提出了一个比较规范的命名规则。 质粒命名规则 1. 第一个字母一律用小写p表示 2. 后面两个字母应该大写，可以采用发现者人名，实验室名称，表型形状或其他特征的英文缩写 例如：UC----University of California BR----Bolivar and Rodrigue 3 编号为阿拉伯数字，用于区分同一类型的质粒 后续比较复杂的质粒命名都是对Vector base质粒按照自身需求改造后进行重新命名。 如下图的质粒 pLV-puro-N-Flag-Snrnp40pLV+抗性puro基因+N端FLG标签+插入基因snrnp40 基本上复杂命名的组成为 p(骨架载体)+启动子/标签+(物种缩写)插入基因+筛选标签+抗性基因+过表达/敲除 下面是常见的骨架载体缩写： RP: Regular plasmid，常规质粒载体 LV: Lentivirus，慢病毒载体 MMLV: MMLV retrovirus，MMLV逆转录病毒载体 AV: Adenovirus，腺病毒载体 AAV: Adeno-associated virus，腺相关病毒载体 Tol2: Tol2 transposon，Tol2转座子 ET, BAD or CS：各种细菌蛋白表达载体 SC: Saccharomyces cerevisiae，酿酒酵母蛋白表达载体 BV: Baculovirus，昆虫杆状病毒蛋白表达载体 插入基因物种人(human),小鼠(mouse),大鼠(rat)分别对应缩写字 母“h”、“m”、“r”以及其他的一些物种等，都是类似的 经过上面的介绍，大部分质粒你拿到之后就能对其想表达的组成有个大概的了解，下面就是质粒图谱的介绍 质粒的寄主范围是由ori区决定的 复制起点 复制起点(ori)：控制复制的起始位点，是基因组上复制起始的一段序列，是由起始复制子(复制子：在质粒DNA中能进行自主复制并维持正常拷贝数的一段最小的DNA序列。)及其调控元件组成。ori富含A-T，氢键少，便于打开进行复制。 复制起点影响着质粒的拷贝数，尤其是复制子的类型决定复制质粒拷贝数。所以复制起点与前面讲的严紧型和松弛型质粒有密切的联系。常见的复制子有pMB1 ，ColE1等(具体的其他可以自行在addgenen上进行了解，顺便帮助自己熟悉addgene这个很重要的网站：http://www.addgene.org/)。如下图的pUC系列和pBRR系列都是pMB1复制子，但是质粒图谱上是看不出来的，基本上做个了解即可，自己做到心里有数质粒是什么类型的，拷贝数多少，防止质粒浓度达不到要求。 复制起点还有一个比较重要的点就是穿梭质粒。一个质粒上有两个复制起点，为了使质粒可以在不同类型宿主中存活和复制。上面的都是一个ori复制点，下面的一个质粒有两个ori复制起点，需要仔细找才能发现另外一个。 一个比较明显是ori，有的图谱上会标ori(-)表示革兰氏阴性菌；还有一个圈住的也是一个复制起点，是能repF，金黄色葡萄菌中一种复制子。 最后一个小点是f1 ori 是控制质粒在f1噬菌体中复制的复制起点，形成ssDNA(single strain DNA 单链DNA)。 欢迎关注小乔爱科研公众号进行探讨和指正，谢谢！
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