MatEnergy
酶是一种活性蛋白质。因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。(一) 温 度大曲和麸曲的酶活性，在低温干燥的条件下，可以得到良好的保存。酶的催化作用，只有在一定温度下才能表现出来。酶的作用速度与温度的关系为：当酶蛋白没有因受热而变性时，温度每升高10℃，反应速度增加一倍左右[13]。通常酶的作用速度随温度升高而加速，但温度升高到一定限度后，酶的活性就要钝化，直至完全失活。在酿酒生产中，酶作用的最适温度，应根据生产日的不同而选择。例如，在制备米曲汁糖液时，要求尽快糖化，其最适温度可控制在55—60℃；如用于白酒发酵，发酵期可长达4—5天乃至数月。酿酒中为保持酶活性作用的持久，必须坚持低温入池，低温发酵醇。(二) pH值pH值可改变底物的带电状态，从而影响底物分子与酶的结合。各种酶的特异性表明，酶的活动中心只能结合带某种电荷的离子，包括正电、负电或两性电荷。例如，胃蛋白酶只作用蛋白质的正电离子；胰蛋白酶只作用蛋白质的负电离子；而木瓜蛋白酶只作用蛋白质的两性离子，所以，木瓜蛋白酶最适pH值和它的等电点相同，pH值为5—6。酶分子具有两性电解质的性质，同时pH值也改变了酶分子的带电状态，特别是改变了酶活力中心上有关基团的电离状态。当在某一pH时，酶分子的活动中心，既存在一个带正电的基团，又存在一个带负电的基团，这时，酶与底物结合最容易；当pH偏高或偏低时，其活动中心只带有一种电荷，就会使酶与底物的结合能力降低。例如，蔗糖酶当处于等电点时，才具有酶活性，而在等电点的偏酸或偏碱的一侧，酶活性则降低甚至完全丧失。又如，糖化酶作用的最适pH值在5左右，这个最适pH值即为该酶的等电点，高于或低于这个pH值，对糖化酶的作用都不利。酒醅是在酸性环境下糖化发酵的，当酒醅的pH值在5以下，糖化酶则钝化失活，如继续变酸，则逐渐成为不能糖化发酵的死醅；反之，当用石灰水中和酸度至pH5以上，甚至呈强碱性时，糖化酶也将发生钝化，直至完全失去活性。通常酒醅在发酵过程中是逐步生酸的，所以掌握酒醅的入池酸度应在pH5以上。在正常发酵生酸时，要逐步调整到pH5。由于各种有机酸的氢离子解离度不同，通常化验酒醅所测定的酸度，是以毫克当量／10克醅(以乙酸计)表示，而实际酒醅中的酸度来源是以乳酸为主，包括醋酸等多种有机酸的混合物。更确切地说，化验酒醅的入池pH值，比化验酒醅的入池酸度更为有利。酒化酶是酒精发酵一类酶系列的总称，酵母在进行酒精发酵时，同样存在一个最适pH值的问题，酸度常常表现为对酵母的生长和发酵有极大的抑制作用。在所有的挥发或不挥发的有机酸中，越是高级脂肪酸，对酵母的毒性越大。生产实践证明：酒醅或发酵醪的酸度越大，酒精发酵越不旺盛。(三) 酶的浓度和底物浓度酶与底物浓度的关系，一般来说，当酶的浓度较小，底物浓度大大高于酶，则酶的浓度与反应速度成正比；当底物浓度一定时，酶的浓度继续增加到一定值以后，其反应速度并不加快。由于上述关系，过大的增加用曲量是不能收到预期效果的。实践证明，曲大、酵母大，会使发酵前火猛，升温高，生酸快，糖化和发酵作用过早停止；如用曲量太小，则发酵迟缓，酒醅不容易发透，材料干硬，对生产也是不利的。因此，制造白酒使用曲和酵母，必须根据质量，酌情使用，不要贪多。白酒酿造有淀粉浓度大、升温高、酸度大、发酵周期长等特点，因此要求所采用的糖化酶及酒化酶等，应具有耐温、耐酸、耐酒精、酶活性作用持久等特性。一般固态或液态发酵的入池淀粉浓度为14—18％，求战清杂清茶清茬发酵淀粉浓度高达30％以上，因此，在发酵过程中要求糖化酶和酒化酶等具有一定的热稳定性。糖化酶和酒化酶的热稳定性越好，醇活性越不容易受破坏，发酵作用也进行得越彻底。酒醅发酵要产生一定的酸度，而且酸度随温度升高而增加。为了保持酶活性在酸性环境下不致钝化失活，要求糖化酶及酒化酶等具有较大的耐酸特性。一般黑曲霉的糖化酶，比黄曲霉的糖化酶耐酸性更好。所以，近几年来，多以黑曲霉代替黄曲霉作糖化曲酿酒。另外，白酒发酵有较长的发酵周期，因此，要求酶的作用性质具有持久性。对糖化酶要求有前糖化力和后糖化力，即要求有较高的总糖化力。对酒化酶，要求发酵均衡持久，这样，发酵才能有后劲。 
改良碱性磷酸酶染色法[日期：2008-08-11] 来源： 作者：乔海兵，邢开宇 【关键词】 碱性磷酸酶染色法 1939年Gomori首次提出碱性磷酸酶组织化学染色法用于哺乳动物神经系统血管内皮，1951年Gomori修改了自已的 方法 ，并称为“钙钴法”。1984年Bell在Gomori碱性磷酸酶染色法的基础上进行了改良，用于人脑海马和距状裂区的毛细血管取得成功〔1〕。本文以Bell法为基础，对其法的某些步骤进行了简化和改良， 应用 于脑微血管的 研究 ，同时可以显示出脑微动脉、微静脉。现将此法介绍如下。 1 原理 此方法为金属阳离子沉淀法。以β甘油磷酸钠为底物，在酶的作用下，产生磷酸离子与钙离子形成磷酸钙为第一反应产物。经硝酸铅处理变为磷酸铅沉淀，为第二反应产物。两种反应产物均易解离，进一步用稀硫化铵处理，形成稳定的硫化铅颗粒，沉淀于微血管内皮中，光镜下呈黑色〔2〕。 2 方法 1 取材 标本在24 h内取出，切成2 cm×2 cm×2 cm的组织块，放入4 ℃冰箱中保存。尽快放入固定液中固定24 h以上。 新鲜固定液的配制：无水氯化钙 5 g；巴比妥纳 5 g；纯甲醛液 5 ml；蒸馏水 488 ml。 2 脱水 组织固定好之后，移入70％的酒精24 h，依次移入85％酒精4 h，无水酒精，丙酮(1∶1)溶液4 h，无水酒精，乙醚(1∶1)溶液中4 h。 3 包埋 将脱水之后的组织块修整，移入5％的火棉胶溶液中浸泡包埋，放入4 ℃冰箱中，1周后可成块。 4 切片 切片厚度在60 μm左右，置入75％酒精中。 5 孵化 将切片放入孵化液中，在37 ℃恒温箱内孵化2 h～4 h。孵化液的配制：β甘油磷酸钠2 g;无水氯化钙96 g;巴比妥钠1 g;蒸馏水200 ml。 6 染色 将孵化好的切片快速更换3次蒸馏水，马上置入5％硝酸铅溶液中5 min，快速更换3次蒸馏水，然后放入2％硫化铵溶液中3 min，再快速更换3次蒸馏水。 7 裱片、脱水、封片 裱片后脱水，二甲苯透明封片。 3 改良措施 取材要新鲜，以免降低血管内皮碱性磷酸酶的活性。固定液和孵化液配好之后，可不调其pH值，只需用pH试纸测试固定液呈弱酸性，孵化液呈弱酸性即可。包埋过程中 应用 梯度包埋法，火棉胶浓度最高不能超过10％。先将组织块放入5％的火棉胶溶液中，留一小开口，置入4 ℃冰箱中，以利于酒精挥发，每天给容器加满火棉胶。2 d～3 d后改换10％的火棉胶，直至包埋好为止。包埋好的组织块应硬度适宜，用手指轻按可留有指纹，但不易碎。孵化过程适当延长，以利于内皮细胞碱性磷酸酶与孵化液充分反应。在裱片过程中由于切片较厚，切片很容易脱落。可采用先透明后封片的办法，既不 影响 切片的透明度，片子也不容易脱落。 4 讨论 碱性磷酸酶染色属于组化呈色法，由于此法对微血管显色均匀、充分，并可较好的反映正常微血管的 自然 扩张状态，有效地避免了血管灌注法的种种缺憾，而且此法经多次改良，使操作 方法 更为简单，呈色时间缩短，因而成为 目前 较为流行的一种微血管形态学的 研究 方法〔3〕。但Hunzlker等认为，由于小静脉内皮细胞碱性磷酸酶分布不集中，活性较低，因而微静脉难以显示。我们在研究过程中对碱性磷酸酶法进一步改良之后，可显示大量的带有三角形膨大的血管(见图1)，而这一特点正是微静脉所特有的，所以我们认为，并非微静脉用此法不能显示，而是在实验过程中pH值、温度掌握不准所致。 参考 文献 ： 〔1〕王有伟，陈以慈碱性磷酸酶染色法(钙铅法)在研究人脑和心脏微血管方面的应用〔J〕解剖学杂志，9(3)： 〔2〕杜卓民．实用组织学技术〔M〕北京：人民卫生版社，1982： 〔3〕张为龙脑血管研究近况〔J〕临床解剖学杂志，1986，4：
